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| 显微镜下的核移植操作 |
简要概述编辑本段回目录
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| 鲤―鲫鱼 |
鲫鱼和鲤鱼是经常出现在人们餐桌上的两种淡水鱼。它们的亲缘关系比较近。鲤鱼幼小时常常会被误认为是鲫鱼，如果没有注意到它嘴巴边上的两根须的话。但从总体上说，鲫鱼和鲤鱼的区别还是比较大的。鲫鱼的个子小，长到200～300克就不会再长了；鲤鱼是大个子，只要一两年就能长到两三千克重。鲫鱼肉质细嫩肥腴，鲜美可口；鲤鱼的肉较粗较老，滋味比鲫鱼逊。20世纪80年代初，中国武汉的一些生物科学工作者，进行了一项大胆的试验。他们先对鲫鱼的成熟卵细胞“动手术”，设法去除掉它的细胞核。然后又从鲤鱼的胚胎细胞中取出细胞核，让它到上述的鲫鱼细胞中“安家落户”。在他们的精心操作之下，这种换掉了细胞核的鲫鱼卵细胞就像正常的受精卵细胞一样，开始了不断的分裂，最终发育成面目一新的杂交鱼。这种鱼一年就能长到5O0克以上，但外观形态和肉质滋味都酷似鲫鱼，只是嘴巴边上多了两根须。这是一次成功的细胞核移植。不难看出，细胞核移植和细胞融合一样，能向人类提供在大自然里是难以想象的动植物新品种，从而带来巨大的经济效益。
其实，在同种生物中使用细胞核移植技术也有巨大的价值，它能使性状特别优异的品种迅速得到推广。道理很简单，生物个体的体细胞数量总要比生殖细胞多得多，而体细胞细胞核里的遗传物质则与生殖细胞是一模一样的。当人们发现了性状特别优异的动植物体后，用细胞核移植技术，就可以把它大量的体细胞细胞核移植到同种生物的卵细胞里，培养出大量的性状特别优异的后代。
要使移植了细胞核的卵细胞像正常的受精卵细胞那样开始分裂并发育成胚胎，当然会有许多困难。在科学家们的努力之下，这些困难一个个迎刃而解。例如，卵细胞要分裂，细胞核里的染色体必须先要自动加倍。科学家从真菌中提炼出一种叫做“细胞松弛素B”的物质，把这种物质加到卵细胞中去，核里的染色体就会自动加倍，卵细胞的分裂就会顺利开始。
细胞来源编辑本段回目录
哺乳动物核移植是将外源的一个细胞核与一个去核卵母细胞结合，产生遗传上同质的动物的技术。它在动物育种、制备转基因动物、基因治疗及器官移植等方面具有重大的作用。
供体细胞的来源
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| 进行核移植研究的研究生 |
胚细胞
用0.2％链霉蛋白酶预处理胚胎，溶去胚胎的胶膜及透明带，分离出单个卵裂球。消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素，作用时间短，透明带不能充分消化，卵裂球不易获得；作用时间长，则影响到卵质膜，容易破裂，在操作时容易失败。因此，在分离卵裂球时应在解剖镜下监视透明带的消化过程，当透明带变薄，膨胀适度时就应移出，再用适当口径的吸管吹打使之分离。
体细胞
最早用青蛙肠粘膜上皮细胞获得了后代。Wilmut等用绵羊乳腺细胞获得Dolly羊。美国夏威夷大学RyuzoYanagimachi教授领导的一个国际科研小组于1998年以小鼠卵丘细胞为核供体，采用吸移管注入，利用机械和化学激活方式进行细胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。对小鼠、牛体细胞移植的相关研究中发现休眠(G0)的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚，其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞，这可能缘于颗粒细胞上存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥的缘故，它或许有助于供体核同受体核胞质因子的交换。受体细胞的来源
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| 核移植——受体细胞 |
卵母细胞的去核方法
盲吸法用微细玻璃管在第一极体下盲吸，吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质，但该方法成功率低。为提高去核率，利用Hoechst33342染料对染色质的特异性染色作用，在荧光显微镜下去核后判断去核是否完成，去核准确率大为提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml)染色，在紫外线下照射的时间控制在10s以内，未观察到对胚胎发育的负面影响。
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| 操作流程 核移植示意图 |
离心去核Tatham等以150OOg、2min离心牛卵母细胞，用链霉蛋白酶去除卵母细胞透明带(ZP)，经渗透压梯度离心，MⅡ期纺锤体可从大多数卵母细胞中分开，把无透明带的去核胞质作核移植的供质，同分裂球聚集经电融合成核移植胚，最后放入藻酸钠假透明带中，能在体外卵裂和发育，但其效果还有待于进一步研究。
末Ⅱ期去核法Bordignon等提出把卵母细胞先激活使之处于末Ⅱ期，在排出第二极体时吸出第二极体及周围的少量细胞质，从而达到去核。这种方法避免使用DNA染料和经紫外线照射来定位染色体，并且去除的细胞质相对较少。该去核方法比MⅡ期去核的成功率有显著提高，但这种细胞质容易老化，是否能对基因组完全重排序，顺利完成后期发育，有待于研究。
去核时间与去核成功率
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| 核移植——去核 |
胞质容士与重构胚的发育潜力
有人对核反比例与重构胚发育的关系进行研究，结果表明，卵母细胞去除的胞质量与预期供核体积大小相当时，可以为细胞周期的相互作用创造最好的条件，而去除太少或太多并不理想。基于去除细胞质的量与去核率关系密切，因此，在保证有较高的去核情况下。去除的胞质应尽量少。
移植操作编辑本段回目录
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| 核移植科普图 |
移植过程编辑本段回目录
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| 核移植科普图 |
由于微吸管破坏了卵膜和一部分细胞质，若直接移植，成功率很低，故需对重组胚融合，其采用的方法有仙台病毒法、电融合法，后者更常用。电融合时选择的电压范围和脉冲频率取决于融合箱中两个电极的距离。融合箱的距离由2OOμm，到几毫米，因此在脉冲是200μsec倍数且能传导lKV/cm的直流电基本满足要求。对小鼠、家兔等实验动物进行胚胎核移植时还发现，受体卵母细胞在重构胚电融合时被激活的状态与重购胚的发育率密切相关，脉冲强度为2.0-3.6K/cm、融合时间为60-200μsec是适宜范围。若脉冲过强，融合时间过长，对重构胚的进一步发育极为不利。Kono等提出针对不同时期的供体核采取不同激活程序得到了较好的实验结果：①对于G2期和M期的供体核即4倍DNA供体，在融合时可采用不引起卵母细胞活化的仙台病毒或细胞质内注射，然后再给予激活处理，使一半DNA以极体方式排出，随后形成原核及正常2倍体细胞，应用此法已产生了正常的小鼠；②对于G0、G1及S期供体核，可采用融合前激活和融合时激活两种方式，以防止供体核形成中期板而导致染色体的不正常。Szollosi用小鼠胸腺细胞作核移植实验时发现，只有成熟的去核卵母细胞被激活前或激活后30min进行融合，移入的供体细胞核才发生降解，并重新聚合形成新核膜，若超过3Omin再触合，虽然移入的供体核才发生降解，这可能会使供体染色质与受体细胞质诸因子的有效互作受到抑制，从而使再程序化过程受阻。Wakayama等人利用受体卵母细胞化学激活和重构胚化学融合的方法，也在小鼠体细胞克隆和再克隆的研究中取得了理想的结果。
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| 核移植科普图 |
融合率与细胞期
Prather等(1989)研究结果表明，融合率与细胞期无显著差异，说明卵裂球的体积变小对融合率并无显著的影响，张涌(1992)在小鼠研究中也得出类似的结果。Robal等也认为，融合率与受体卵母细胞的时龄有关，并且还与核供体接触的面积和接触的紧密程度有关，而与移入的卵裂球处于什么时期无关，但是重构胚的发育率与供体胚的细胞期是有关的。
温度、卵母细胞成熟时间对卵母细胞激活的影响。随着卵母细胞在体外成熟时间的延长，进而老化，成熟促进因子（MPF）下降，易激活。体外成熟老化的牛卵母细胞对温度诱导激活高度繁感，在一定的温度诱导激活下，卵母细胞染色质聚缩，“自动去核”的频率高。幼稚卵母细胞不容易在室温下激活，即使激活也不稳定，可能逆转到中期。
培养与再移植编辑本段回目录
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| 中国最早的克隆鱼 |
实际应用编辑本段回目录
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| 美国器官移植专家 |
定义细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾病，如糖尿病；中枢神经系统疾病（帕金森，阿尔莫茨症）；肝功能衰竭；甲状腺疾病。
异种器官移植
治疗性克隆是利用核移植技术将病人的体细胞核移植到去核的卵母细胞中，使其重编程并发育成囊胚,然后再用胚胎干细胞分离技术从克隆囊胚的ICM分离出多能胚胎干细胞(ES)。这种干细胞在遗传学上和病人完全一致，再定向诱导其分化成病人所需要的体细胞进行移植，以取代和修复患者已丧失功能的细胞、组织或器官，而达到完全治愈。治疗性克隆不仅解决移植物与受者间的免疫排斥反应问题，而且可以解决移植物的来源问题。
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| 核移植科普图 |
虽然核移植技术有着广阔的应用前景，并且已取得了一些进展如体细胞核移植等，但也存在着一些问题。主要包括核移植效率低，动物畸形。这要求研究人员进一步了解核质作用机理，改进培养方式。
到2007年为止，虽然核移植技术的发展较快，然而该技术还存在许多问题，如核移植成功率普遍比较低、重构胚的发育率低、畸形胚的比率高。体外培养的时间过长或培养液的成份可能导致移植胚的流产以及出生后的仔畜很快死亡。基因重组编程的机制尚不清楚，其中MPF、NEBD(核膜破裂)和PCC在基因组重编过程的作用还需阐明。基因印记对核移植重新编程的影响以及基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系，还不清楚。
相关词条编辑本段回目录
参考资料编辑本段回目录
[1] 中国生物技术信息网 http://www.biotech.org.cn/
[2] 中国显微显像图像网 http://www.microimage.com.cn/
