巴甫洛夫在研究消化生理学的最后一段时间里，观察到动物看到和嗅到食物即流涎、产生唾液和胃液的“心理性”分泌。这一现象就是我们平常所说的“馋得流口水”。为什么会发生“馋得流口水”这一现象？有人唯心地断定，那是因为狗与人一样有思想，它想吃，它希望吃，所以流口水；也有人认为，心理作用是灵魂活动，它是不可知的，不仅现在，将来也永远弄不清，但这一现象却促使巴甫洛夫开始对高级神经活动生理学进行研究。
巴甫洛夫的同事格林斯基于1895年重新改进了1979年第一次实施地唾液腺瘘管装置。手术仅用了15分钟。一系列的实验证明：动物看到食物和嗅到食物就已经能引起要求消耗一定浓度和数量食物的流涎。这种现象成为巴甫路夫研究无条件反射和条件反射的出发点。
1903年，巴甫洛夫出席在西班牙马德里举行的国际医学会议，作了一个题为《动物实验心理学和精神病理学》的报告，正式宣布了自己的决心和企图：用生理学的科学实验方法，来研究心理现象和大脑两半球的活动规律。这是一个数千年来科学所没有解决的重要问题。从第二年开始，巴甫洛夫就致力于研究反射和人的高级神经活动，一直到他生命的最后时刻。在长达35年时间内，巴甫洛夫为了这个任务坚持不懈地努力，终于取得了重大的胜利。
19世纪许多学者已经确定了精神活动就是中枢神经系统高级部位的机能，但是这种见解基本上带有直观的性质，没有经过直接的可靠的实验材料所论证。究竟怎样去认识脑在起作用，其活动规律怎样，什么样的过程是这一活动的基础，这种过程的发生情况怎样等都还没有找到真正的答案，研究脑机能的生理学家都处于困惑状态中。巴甫洛夫说：“我们有权利这样说，从伽利略时代开始的势不可挡的的自然科学进程，第一次在脑的高级部位面前，或者一般地说，在动物与外在世界发生极其复杂关系的那个器官面前，显著地停顿下来了。这并不是没有原因的，这是自然科学的真正危急的关头，因为创造过并正在创造着自然科学的那个发展到高级形态的脑――人脑本身也变成了这一自然科学的研究对象了。”
巴甫洛夫吸取了达尔文的进化论和“俄国生理学之父”谢切诺夫的“反射论”的精华，系统地进行研究，他以狗和猿做实验对象，作了一系列各种不同的实验。研究开始时，巴甫洛夫对他暂时地称“心理性”的唾液分泌现象作了种种推测，并提出了一个比较合理的解释：“难道这种现象不是一种反射作用吗？它很可能是一种特殊类型的反射作用。”
反射这一概念是法国哲学家和自然科学家笛卡尔在巴甫洛夫出生前二百年提出的。笛卡尔认为，动物机体的每一种活动，都是对外界剌激的必然反应，而这些反应，是通过神经系统实现的。这种反应就叫反射。谢切诺夫认为，人类的意识也是一种反射活动，并企图尝试用生理学解释心理现象产生的方式。他的著作《脑的反射》是巴甫洛夫条件反射学的先声。但是，谢切诺夫的论述在当时并没有实验证明。
巴甫洛夫从谢切诺夫的论点出发。按照谢切诺夫的论点，动物和人都具有一种天生的、同现有解剖反射路线相合的、而且在出生时就具有充分功能能力的反射。比如，婴儿生下来会吮奶、吞咽、手指碰到烫的东西会马上缩回，睛眼突然看到强光瞳孔会缩小，食物进口会分泌唾液等等。这些都是人和动物先天就有的本能，不需要任何训练，而且能一直保持下去。巴甫洛夫把这类先天性反射称之为“非条件反射”。
除了“非条件反射”以外，巴甫洛夫又发现了另一类反射，既获得性反射。这种获得性反射只有在个体发育期间才能形成。比如，只要把肉放在狗的面前，并没有让它吃到嘴里，狗就会流口水。巴甫洛夫认为，这是因为狗在以前多次吃肉的时候，首先看到了肉的形状，嗅到了肉的气味，然后，当肉进入嘴里时，味觉器官尝到肉的味道，便引起了非条件反射的唾液分泌。视觉、嗅觉、味觉器官所受到的剌激传入中枢，在狗的大脑皮层的不同区域，形成三个兴奋灶。久而久之，这三个兴奋灶之间的联系渐渐加强，得以巩固，以致肉的形状和气味一旦在狗面前出现，就可以如同肉已经吃到嘴里一样，引起唾液分泌的反射。这一类反射是后天形成的，巴甫洛夫把它称做“条件反射”。这就是所谓“心理性”分泌的生理过程。
条件反射不可能是先天就有的。巴甫洛夫做过这样的实验，他把肉投给一只出生后只吃奶而从来没吃过肉的狗，这只狗不仅不分泌一滴唾液，而且仅仅用鼻子嗅嗅，观察观察就走开了。巴甫洛夫把肉突然送到这只狗的嘴边，这只狗不但不张嘴来咬肉，反而把头转过去，避开了肉。
非条件反射是永存的，而条件反射则不是永存。如果生活条件有所变化，旧的条件反射便会消退，而新的条件反射又可以建立起来。巴甫洛夫是这样实验的，狗看到肉会流口水，巴甫洛夫就重复地只让狗看到肉而不让狗吃肉，结果是狗的唾液分泌会一次比一次减少，到后来，竟然一点都不分泌了。因此可见，条件反射的形成，发展与消退，能使动物对于它的生活条件和周围环境有更灵活和更精确的适应能力。
巴甫洛夫为了证实他的条件反射学说，科学地测定唾液分泌的情况，他在狗的颊部开刀，造成一个瘘管。狗的口腔里一共有三条唾腺：腮腺、颌下腺和舌下腺。巴甫洛夫把两个腮腺中的一个造成瘘管，瘘管的开口通往一个仪器，这是一台可以测出十分之一滴唾液分泌的高度灵敏的仪器。在具体实验的时候，让狗与外界的声和光等隔绝，只接受研究人员给予的剌激信号。实验的结果发现，至多只要几十次，就能使狗形成对某一信号的条件反射。
巴甫洛夫用与食物无关的条件如铃声或灯光来剌激狗，狗决不会见到灯光或听到铃声而分泌唾液。但若把铃声或灯光和食物联系在一起，即每次给狗喂食物时铃声响起来，或灯光亮起来，这样的实验少则几次，多则十几次，几十次后，即使不给狗吃食物，只要铃声响起来或灯光亮起来，就会使狗的唾液腺产生反应，分泌唾液。这是因为灯光或铃声造成的视觉剌激或听觉剌激和食物造成的味觉剌激，在大脑皮层里建立了暂时性的联系，所以狗对灯光铃声产生了条件反射。
剌激信号不仅仅是铃声和灯光，就连脚步声、流水声、甚至用棍子打狗、用烙铁烫狗、用针剌狗，只要同食物联系在一起，就都会形成条件反射，以致于狗挨了打、烫或剌、就立刻会垂涎三尺。因为狗对于剌激信号非常灵敏，经过特殊训练的狗这方面的能力更独特，警犬能毫无困难地分辨出多至50万种以上不同的气味。对警犬的训练就是应用了巴甫洛夫的条件反射学说。
无数次的实验证实了条件反射学说。巴甫洛夫发现了“条件反射”，就是发现了动物界和我们人类本身的基本的、同时也是最普通的现象。巴甫洛夫说：“在狗身上试验唾液腺的反射，等于狗把许多事情告诉了我们。”
人为的实验可以制造某一重复剌激，作为形成条件反射的信号。动物或人类在自然界中，又是怎样从许多剌激中找出一些具有信号意义的剌激来呢？研究表明，条件反射是由“内在和外在环境中的各种各样的初级的或最复杂的复合动因形成的，不过要受一种限制：为了感知这一切动因，在大脑半球中就必须有感受的要素”。巴甫洛夫认为，这主要是依靠大脑皮层的功能。他认为，条件反射是以非条件反射为基础形成的，可以设想在条件反射形成后，条件剌激的神经通路和非条件反射的神经通路之间必定发生一种新接通的暂时联系，暂时联系发生在大脑皮层的有关中枢神经之间，即在条件剌激的皮层兴奋灶与非条件剌激的皮层兴奋灶之间，由于多次结合强化，而建立了暂时联系，所以巴甫洛夫说：“外部动因与机体对外部动因所作的反应活动之间的经常联系理应叫做非条件反射，暂时性联系则应叫做条件反射。”巴甫洛夫认为，条件反射的一个极其重要特点就是反射的暂时性。
巴甫洛夫把感受器、传入神经纤维和相应的中枢神经部分比做简单的分析器。感受器官只具备初步的分析能力，每一种感受器官只能接受一种性质的刺激，如眼睛对光线，耳朵对声音，舌头对味道；当它们接受了一定的刺激后，就通过神经纤维传达到神经中枢的某个低级部位――这部位在脑干内，从而引起一定的动作，例如：眼睛遇到强光会缩小瞳孔，舌头一尝味道就会分泌唾液。这些都是简单的反射，也就是非条件反射。但是，大脑两球皮层好象是一个灵敏度极高的分析器总体，它能把刺激的强度和性质分析得很精细，同时也能把不同部位、不同强度以及不同时间出现的刺激，给以很好的综合，形成一个总的复合刺激，因而也就能引起各种各样极其复杂的反射，就是巴甫洛夫所说的条件反射。
巴甫洛夫通过实验来证实大脑皮层的功能。他用精细的手术把一只狗的大脑皮层（灰质）切除，而保留神经中枢的其余部分。结果，便制造了一个具有明显行为缺陷的严重的“残废者”。在这只狗身上属于非条件反射的本能行为都还存在，它仍然会走会跳，会吃食物，甚至也能生育；但是，在这只狗身上原先已建立起来的旧的条件反射则完全丧失了，而新的条件反射无论如何也建立不起来了。这只狗不再认识它的主人了，主人抚摸它，它无动于衷，恐吓它也不逃走；把食物放在它的面前它也不知道吃，根本也不流口水；它走来走去，到处乱嗅，不会根据食物的信号去找食物，只有当嘴巴偶然碰到食物时或把食物放入在它嘴里，它才会吃下去，如果没有人工饲养，这只狗必定会饿死无疑。所以实验证明：条件反射是大脑皮层的反射活动，是一种典型的大脑活动，是大脑复杂规律的一个基本环节。
巴甫洛夫的条件反射学说的生物学意义在于：他具体地、科学地阐明动物机体如何同它的周围环境建立精确的相互关系，根据对生命活动有的或不利的不同剌激信号，决定其行动，产生精确的反应，使动物机体本身更适应于生存环境，生存下去。动物在自然环境中会根据食物的信号（气味、颜色、形状等）去寻找食物，不是等待食物送上门来，掉到自己嘴里。动物也会根据危险的信号而避开危险，以保存自己的生命。尽管猛兽的形体和声音对于小动物来说不是致命的东西，但猛兽的爪和牙则可以毁灭小动物，如果弱小动物非要在猛兽的爪和牙接触到自己身上时才开始反应，那就太晚了。因此小动物在得到猛兽的形体和声音的信号时就要有所反应才能得到保护。当环境改变时，动物也会随着环境的变化而形成新的条件反射，来适应新的环境。
巴甫洛夫的条件反射学说在哲学上也具有重大的意义，条件反射学说同巴甫洛夫以后提出的两个信号系统学说有力地证明了这样一个观点：人的主观意识是客观现实在人脑中的反映。巴甫洛夫以自己的科学研究成果为辩证唯物主义认识论提供了充分的自然科学基础。
